طراحی بیوانفورماتیکی و ساخت کاست ژنی دربردارنده‌ی ژن‌های blf1، ctxB و stxB

نویسندگان
زهرا مشیری 1
رحیم حداد 1
حسین هنری 2
1 گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه بین‌المللی امام خمینی(ره) قزوین، ایران
2 مرکز علم و فناوری زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران
چکیده
مقدمه

باکتری بورخولدریا سودومالئی، ویبریوکلرا و شیگلا دیسانتری عامل بیماری میلوئیدوزیس، وبا و شیگلوز در انسان می­باشند. پروتئین­های BLF1 مربوط به B. pseudomallei، ­CTxB ویبریوکلرا و StxB شیگلا دیسانتری خاصیت آنتی­ژنیک، ادجوانتی مخاطی، حاملی و ایمنی‌زایی دارند. هدف این مطالعه، ساخت کاست ژنی دربردارنده­ی ژن­های blf1، ctxB وstxB و بیان­ پروتئین آن­ها در E. coli می­­­باشد.

مواد و روش­ها

با استفاده از نرم­افزار­های بیوانفورماتیک Protparam و Modeller، حالت­های مختلف پروتئین کایمریک ژن­های مربوطه بررسی شد. ساختار دوم پروتئین و اپی­توپ­های خطی و ساختاری نیز تعیین گردید. ژن‌های blf1 و stxB از پلاسمید pET28a-BLF1-STxB، PCR و قطعه 850 جفت بازی BLF1-STxB با جایگاه­های آنزیمی NotI وSalI در وکتور بیانی pET28a-CTxB زیرهمسانه­سازی و به باکتری E. coli سویه­ی BL21(DE3) ترانسفورم شد. پس از توالی‌یابی، بهینه‌سازی بیان ژن سنتزی تحت القایIPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) و درجه حرارت 25 درجه سانتیگراد انجام و بوسیله تکنیک SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت.

یافته­ها

شاخص ناپایداری پروتئین کایمر برابر با 06/40 و نیمه­عمر آن در E. coli بیش از 10 ساعت به دست آمد. شاخص سازگاری کدون سازه­ی کایمر به 9/0 و محتوای GC آن به 9/54 درصد افزایش یافت. بهترین ترتیب ممکن برای ساخت واکسن نوترکیب، ممزوج سه­تایی CTxB-BLF1-STxB بدست آمد. بیان پروتئین نوترکیب از ژن سنتزی تحت القای IPTG، منجر به تولید پروتئینی با وزن مولکولی 48 کیلودالتون شد.

نتیجه­گیری

با توجه به توانایی توقف پروتئین­سازی BLF1، خاصیت حاملی STxB و خاصیت ادجوانتی CTxB، قرار دادن این سه ژن در یک کاست ژنی به بهترین حالت، می­تواند به عنوان یک کاندید واکسن مناسب مورد توجه قرار گیرد.
کلیدواژه‌ها
بورخولدریاسدومالئی
سم بی ال اف 1
میلوئیدوزیس
وبا
شیگلوز

عنوان مقاله English

Bioinformatic Design and Construction of a Chimeric Gene Comprising the stxB, ctxB and blf1 Genes

نویسندگان English

zahra moshiri 1
raheem haddad 1
hosein honari 2
1 Department of Biotechnology, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran
2 Biological Research Center, Imam Hossein Comprehensive University. Tehran, Iran
چکیده English

Introduction

bacteria species; Burkholderia pseudomallei, Vibrio cholera, and Shigella dysenteriae are the main pathogen causing Melioidosis, Cholera, and Shigella in humans respectively. bacterial species have a protein that has antigenic prosperities along with being a mucus based adjuvant thus easing their delivery and immunogenicity. These proteins were BLF1(B. pseudomallei), CTxB (V. cholera), and StxB (S. dysenteriae). The goal of this study was a chimeric gene composed of Blf1, CTxB, and StxB and expression of these proteins from E.coli.

Materials and Methods

Using Bioinfoamtic tools such as Protparam and Modeller the different combinations of the chimeric protein were assessed. The blf1 and stxB genes were PCR amplified from pET28a-BFL1-StxB. The 850bp fragment encompassing BFL1-StxB was cloned using SalI and NotI in the pET28a-CTxB vector. The engineered plasmid was transformed in BL21(DE3). The ctxB-stxB-blf1 gene was expressed following induction with IPTG. This induction was then assessed using SDS-PAGE.

Results

Chimeric protein instability index gets 40.06 and the half-life of it in E. coli was over 10 hours. Codon Adaptive Index (CAI) rise to 0/9 and GC content increase to 54.9. The optimal vaccine combination for the chimeric protein was determined to be CTxB-BLF1-StxB. Expression of recombinant protein in E. coli led to the production of a chimeric protein with 48 kDa molecular weight.

Conclusion

The findings of the current study revealed that this antigen can be raised as a recombinant vaccine candidate which can be due to such factors as a property of the ability to stop protein synthesis in BLF1, CTxB adjuvant, and delivery of StxB protein.

کلیدواژه‌ها English

Burkholderia pseudomallei
BLF1 toxin
Melioidosis
1. Titball RW, Burtnick MN, Bancroft GJ, Brett P. Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei vaccines: are we close to clinical trials? Vaccine. 2017;35(44):5981-9.
2. Wiersinga WJ, Currie BJ, Peacock SJ. Melioidosis. “N. Engl. J. Med.”.. 2012; 367(11):1035-44.
3. Chu J, Pelletier J. Targeting the eIF4A RNA helicase as an anti-neoplastic approach. BBA, Gene Regul. Mech. 2015;1849(7):781-91.
4. Cruz-Migoni A, Hautbergue GM, Artymiuk PJ, Baker PJ, Bokori-Brown M, Chang C-T, et al. A Burkholderia pseudomallei toxin inhibits helicase activity of translation factor eIF4A. Science. 2011;334(6057):821-4.
5. Malina A, Cencic R, Pelletier J. Targeting translation dependence in cancer. Oncotarget. 2011; 2(1-2): 76-88.
6. Masoudi Kerahroudi M, Honari H, E'temad aubi Sm, Abdollahi M. Comparison of the Titers of Produced Antibodies against BLF1 and BLF1-STxB Recombinant Proteins in Laboratory Rats. SJIMU. 2019;26(6):111-21.
7. Masoudi Kerahroudi M, Honari H, abdollahi m. Expression of Blf1-Stx B Gene Cassette in E. coli and Investigation Antibody Titer in Mice. JSSU. 2017;24(11):876-86.
8. Masoudi Kerahroudi M, Honari H, Minaei ME, Abdollahi M. Expression of blf1 Gene of Burkholderia pseudomallei in Escherichia coli and Assessment of Antibody Titer in Mouse. Qom Univ Med Sci J. 2017;11(10):30-9.
9. Puzari M, Sharma M, Chetia P. Emergence of antibiotic resistant Shigella species: A matter of concern. JIPH. 2018;11(4):451-4.
10. Honari H, Amlashi I, Minaei M, Safaei S. Immunogenicity in guinea pigs by IpaD-STxB recombinant protein.AMUJ. 2013.
11. Engedal N, Skotland T, Torgersen ML, Sandvig K. Shiga toxin and its use in targeted cancer therapy and imaging. Microbial biotechnology. 2011;4(1):32-46.
12. Lunelli M, Lokareddy RK, Zychlinsky A, Kolbe M. IpaB–IpgC interaction defines binding motif for type III secretion translocator. PNAS. 2009;106(24):9661-6.
13. Oladokun MO, Okoh IA. Vibrio cholerae: A historical perspective and current trend. "Asian Pac. J. Trop. Dis.".. 2016;6(11):895-908.
14. Odumosu O, Nicholas D, Yano H, Langridge W. AB toxins: a paradigm switch from deadly to desirable. Toxins. 2010;2(7):1612-45.
15. Shen My, Sali A. Statistical potential for assessment and prediction of protein structures. Protein Sci. 2006;15(11):2507-24.
16. Nazarian S. An in silico chimeric multi subunit vaccine targeting virulence factors of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) with its bacterial inbuilt adjuvant. "J. Microbiol. Methods" 2012:36-45.
17. Puigbo P, Guzman E, Romeu A, Garcia-Vallve S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 2007;35(suppl_2):W126-W31.
18. Garg VK, Avashthi H, Tiwari A, Jain PA, Ramkete PW, Kayastha AM, et al. MFPPI–Multi FASTA ProtParam Interface. Bioinformation. 2016;12(2):74.
19. Amerian M, Nazarian S, Honari H, Minaie ME, KORDBACHEH E. Insilico Design and Construction of a Chimeric Gene Comprising the A Subunit of Vibrio cholera Pilin and the B Subunit of Cholera Toxin. Iran J Med Microbiol. 2017.
20. Barrick JE, Roberts RW. Sequence analysis of an artificial family of RNA‐binding peptides. Protein Sci. 2002;11(11):2688-96.
21. Banerjee R, Das B, Nair GB, Basak S. Dynamics in genome evolution of Vibrio cholerae. Infection, Genetics and Evolution. MEEGID. 2014;23:32-41.
22. Baldauf K, Royal J, Hamorsky K, Matoba N. Cholera toxin B: one subunit with many pharmaceutical applications, Toxins, 7, 974–996. CrossRef PubMed PubMedCentral Google Scholar. 2015.
23. Jafari D, DEHGHAN NF, Honari H, Hoseini R, Jafari R. Bioinformatic analysis of different fusions of ipaD, PA20 and CTxB antigens: a preliminary analysis for vaccine design. Genetics in the Third Millennium. 2016.
24. Eramian D, Shen My, Devos D, Melo F, Sali A, Marti‐Renom MA. A composite score for predicting errors in protein structure models. Protein Sci. 2006;15(7):1653-66.
25. Madanchi H, Honari H, Sadraeian M, Hesaraki M. Fusion of CtxB with StxB, Cloning and Expression of in Esherichia coli: A challenge for Improvement of Immune Response Against StxB. "Iran. J. Pharm. Sci.". 2011;7(3):185-90.
26. Kundu J, Mazumder R, Srivastava R, Srivastava BS. Intranasal immunization with recombinant toxin-coregulated pilus and cholera toxin B subunit protects rabbits against Vibrio cholerae O1 challenge. FEMS IMMUNOL MED MIC. 2009;56(2):179-84.
27. Patwary NIA, Islam MS, Sohel M, Ara I, Sikder MOF, Shahik SM. In silico structure analysis and epitope prediction of E3 CR1-beta protein of Human Adenovirus E for vaccine design. Biomed. J. 2016;39(6):382-90.
28. Faruque SM, Albert MJ, Mekalanos JJ. Epidemiology, Genetics, and Ecology of Toxigenic Vibrio cholerae. “Microbiol. Mol. Biol. Rev.”. 1998;62(4):1301-14.
29. Honari H, Minaei H, Ebrahim M. Analyzing the Various Fusions for ctxB, ipaD and stxB Genes of Shigella Dysenteriae and Vibrio Cholera by Bioinformatics Tools. Genetics in the 3rd Millennium. 2013;11(2):3070-77.
30. Dertzbaugh M, Elson C. Reduction in oral immunogenicity of cholera toxin B subunit by N-terminal peptide addition. Infect. Immun.. 1993;61(2):384-90.